實(shí)時(shí)定量PCR的原理、探測化學(xué)物質(zhì)及探針優(yōu)化

                         上海基屹生物闡述實(shí)時(shí)定量PCR的原理及探測化學(xué)物質(zhì)

 

實(shí)時(shí)定量PCR原理

    對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可重復(fù)性的定量長期以來一直是科學(xué)家和研究者的目標(biāo)。傳統(tǒng)的方法需要對終產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。這種方法可以確定目的產(chǎn)物和競爭產(chǎn)物的大小，估算純度，計(jì)算條帶強(qiáng)度。然而，所用擴(kuò)增試劑和體系的變動會造成擴(kuò)增的終產(chǎn)物的重復(fù)性有較大的變動，成為這種方法的主要弊端。擴(kuò)增過程的指數(shù)期提供給我們zui有用的，可重復(fù)的數(shù)據(jù)。在起始的目的DNA量與循環(huán)過程的指數(shù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物量之間存在著定量關(guān)系。這正是實(shí)時(shí)擴(kuò)增的基礎(chǔ)。隨著DNA內(nèi)嵌染料和探針特異性化學(xué)的發(fā)展，實(shí)時(shí)探測量子學(xué)的跳躍發(fā)展推動了對擴(kuò)增過程的研究進(jìn)展。

    今天的實(shí)時(shí)設(shè)備由熒光讀數(shù)計(jì)和熱循環(huán)儀組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)來進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控。用戶能夠根據(jù)一個(gè)一個(gè)的循環(huán)知道那個(gè)樣品正在擴(kuò)增。這些即時(shí)的數(shù)據(jù)允許用戶看清楚各個(gè)樣本相對于標(biāo)準(zhǔn)品，陽性對照和陰性對照是如何擴(kuò)增的。用戶不僅能在擴(kuò)增過程中監(jiān)督整個(gè)反應(yīng)，還可以根據(jù)反饋的信息來優(yōu)化相應(yīng)程序。因此增加了敏感性，特異性和有效性。

    正常化后的數(shù)據(jù)畫成熒光值相對于循環(huán)數(shù)的對數(shù)圖。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正常化處理來彌補(bǔ)背景熒光的差異。正常化后可以設(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為zui大，這樣可以獲得zui準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。


探測化學(xué)物質(zhì)

有5種主要類型的探測化學(xué)物質(zhì)用于實(shí)時(shí)擴(kuò)增，包括： 
1 內(nèi)嵌染料 
2 雙標(biāo)記探針 
3 FRET探針 
4 分子信標(biāo) 
5 Ampliflor

1內(nèi)嵌染料（Sybr-Green I ）

內(nèi)嵌染料，例如Sybr-Green I ，能與雙鏈DNA結(jié)合 
a） SG不與單鏈DNA結(jié)合，熒光信號強(qiáng)度較低 
b） SG與雙鏈DNA結(jié)合，熒光信號強(qiáng)度極大的增強(qiáng)

SG是一種熒光染料，能結(jié)合到DNA雙螺旋的小溝。處于溶解狀態(tài)的未結(jié)合染料顯示低的熒光強(qiáng)度，一旦結(jié)合到雙鏈DNA之后熒光信號增強(qiáng)。這種特性被利用在實(shí)時(shí)擴(kuò)增中。由于在擴(kuò)增反應(yīng)中DNA增加，染料結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物上，熒光信號增強(qiáng)。熒光信號相對背景水平的增加進(jìn)行分析。根據(jù)擴(kuò)增子的長度有多個(gè)熒光染料的分子結(jié)合到雙鏈DNA上。內(nèi)嵌染料可以所有其他傳統(tǒng)擴(kuò)增成分，例如水，緩沖液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到擴(kuò)增反應(yīng)管中。因?yàn)椴恍枰O(shè)計(jì)序列特異性探針和新的引物對，這種方法是一種簡便 ，性價(jià)比較高的實(shí)時(shí)監(jiān)測方法。

內(nèi)嵌染料沒有序列特異性，可以結(jié)合到包括非特異產(chǎn)物和引物二聚體在內(nèi)的任何dsDNA上，因此有必要區(qū)分目標(biāo)信號和假信號。內(nèi)嵌染料可以在反應(yīng)末尾對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點(diǎn)緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點(diǎn)，實(shí)時(shí)儀器連續(xù)監(jiān)測每個(gè)樣品的熒光值。基于產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物會在不同的溫度點(diǎn)解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進(jìn)行微分可以計(jì)算出溶解峰。


溶解峰反映了反應(yīng)中擴(kuò)增到的產(chǎn)物。這些峰是凝膠電泳中條帶的類似物。因此，用溶解曲線數(shù)據(jù)對SG反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督。

2 雙標(biāo)記探針

雙標(biāo)記探針是一種短的寡核苷酸序列，5‘末端連接有熒光報(bào)告染料，3‘端連接有熒光淬滅分子。由于這種探針只有15-25bp長，報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊密接近，幾乎探測不到熒光信號。在循環(huán)過程中，Taq DNA聚合酶對每個(gè)引物進(jìn)行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸過程中會切除下游的探針。一旦探針被降解，報(bào)告染料就會與淬滅分子相分離。 
a） 報(bào)告染料R發(fā)射的能量被淬滅分子Q所吸收和淬滅。 
b） 聚合酶的外切核酸酶活性通過水解方式將報(bào)告染料與淬滅分子相分離導(dǎo)致了熒光信號的增加。

在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)由于切開了探針因此實(shí)時(shí)設(shè)備探測到報(bào)告染料的增加。由于報(bào)告染料被切開，因此不能進(jìn)行溶解曲線分析。雙標(biāo)記探針比內(nèi)嵌染料有更高的特異性，這里有2個(gè)原因 ：
  首先，雙標(biāo)記探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補(bǔ)區(qū)。

  第二個(gè)原因是雙標(biāo)記探針對每擴(kuò)增的一個(gè)拷貝只釋放一個(gè)分子的熒光染料。由于雙標(biāo)記探針增加了特異性，這種探測方法很適合檢測低拷貝數(shù)的模板。


3．FRET 探針

FRET 
探針依靠熒光能量從一個(gè)熒光染料到另一個(gè)的傳遞。兩個(gè)獨(dú)立的特異寡核苷酸序列都標(biāo)記上熒光基團(tuán)。上游探針在3‘末端有一個(gè)供體基團(tuán)，下游探針在5‘末有一受體基團(tuán)。設(shè)計(jì)探針時(shí)他們在與目標(biāo)序列結(jié)合時(shí)互相臨近，使供體和受體熒光基團(tuán)緊密接近。一旦探針雜交到模板上，從供體到受體熒光基團(tuán)的能量傳遞產(chǎn)生了一個(gè)不同波長的熒光信號。供體熒光信號的減弱和受體熒光信號的加強(qiáng)都能分別監(jiān)測到。因此，只有當(dāng)兩個(gè)探針都結(jié)合上去才能檢測到熒光信號。FRET 
探針可以進(jìn)行溶解曲線分析，對基因型分析，SNP檢測和其他突變檢測非常有用。

a） 擴(kuò)增循環(huán)中，兩個(gè)探針與靶DNA退火 
b） 供體被外部光源激發(fā)通過能量傳遞導(dǎo)致發(fā)射熒光的產(chǎn)生。

4 分子信標(biāo)

第四種檢測方法是分子信標(biāo)（MB）。這種探針的基本特征是有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在此結(jié)構(gòu)的一個(gè)末端有一個(gè)熒光染料報(bào)告基團(tuán)，在另一個(gè)末端有一個(gè)淬滅分子。 
這個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)能使MB探針在不雜交時(shí)保持折疊狀態(tài)，報(bào)告基團(tuán)和淬滅分子處于接近的距離，幾乎沒有熒光信號發(fā)出。然而，當(dāng)MB與模板雜交時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)色團(tuán)不會被淬滅。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)時(shí)儀器能探測到熒光信號。用MB探針也可以進(jìn)行溶解曲線分析。

a） 分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)淬滅了熒光信號 
b） 雜交后開始發(fā)射熒光信號

得益于實(shí)時(shí)探測技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用數(shù)量和應(yīng)用類型影響深遠(yuǎn)。其中的一些益處包括有機(jī)體的鑒定，診斷性檢測，基因表達(dá)研究，突變檢測，SNP檢測，基因型和微陣列結(jié)果確證等。每種不同的化學(xué)物質(zhì)根據(jù)應(yīng)用的不同會提供給用戶不同的便利。應(yīng)該注意的是，得益于實(shí)時(shí)測技術(shù)并建立在熒光化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)上的還有其他檢測核酸的等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)。

5 AmplifluorTM直直接基因系統(tǒng)

AmplifluorTM直直接基因系統(tǒng)基本特征是激發(fā)的熒光進(jìn)行分子能量轉(zhuǎn)移到受體成分導(dǎo)致熒光發(fā)射的淬滅。目標(biāo)特異性AmplifluorTM直引物包含一個(gè)5‘內(nèi)部互補(bǔ)序列，標(biāo)記有熒光發(fā)色（fluorescerin）和一個(gè)能量受體：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3‘端序列是目標(biāo)特異性引物區(qū)。未結(jié)合的AmplifluorTM直引物由于內(nèi)部熒光發(fā)色團(tuán)和淬滅分子的緊密接近，只有低的熒光信號。

在*個(gè)循環(huán)中，Amplifluor引物1與特異CDNA的*條鏈退火并被Taq酶延伸。在 第二個(gè)循環(huán)中 
Amplifluor引物1延伸產(chǎn)物作為引物2（反義鏈引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor發(fā)夾引物解折疊并產(chǎn)生熒光信號。隨后的擴(kuò)增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號的增強(qiáng)與擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加成比例。